氯氰菊酯降解菌DZS—3的分离鉴定及其特性(3)

　　3）生理生化鉴定。为明确菌株的生理生化特性，对菌株作了以下试验：碳源利用试验，产酸试验，产H2S试验，淀粉水解试验，甲基红试验，明胶液化试验，V.P.试验，吲哚试验。试验方法参照文献[6]。

　　1.2.6 菌株对抗生素的敏感性将菌株用富集培养基培养后，取10 μL接入含相应抗生素的LB培养基中，观察菌株在抗生素种类和浓度的敏感性。其中，抗生素的浓度分别为氨苄青霉素60 、20、10 μg/mL;卡那霉素50、10、2 μg/mL;链霉素50、10、2 μg/mL;氯霉素100、25、5 μg/mL。

　　2 结果与分析

　　2.1 氯氰菊酯降解菌的筛选

　　从生产氯氰菊酯的工厂附近采集样品，以氯氰菊酯为惟一碳源、氮源筛选具有降解农药能力的微生物。通过在含有氯氰菊酯的无机盐培养基中反复驯化以及无机盐平板上多次划线分离、纯化，初步得到9株降解氯氰菊酯的菌株。为维持降解菌降解能力的稳定性，后经进一步的复筛，将筛选得到的9株降解菌经过扩大培养、涂布含氯氰菊酯的无机盐平板，得到3株生长良好的降解菌。经紫外扫描分析，氯氰菊酯在278 nm处有最大吸收峰，确定一株高效降解氯氰菊酯的菌株，命名为DZS-3。图1为3 d内菌株DZS-3对氯氰菊酯降解情况及对照的紫外扫描图。

　　2.2 DZS-3对氯氰菊酯的降解率及降解趋势

　　氯氰菊酯降解率=[1-（实测残量/对照样实测残量）]×100%[7]。

　　气相色谱的灵敏度较高，为精确计算高效降解菌DZS-3的降解率，实验室用气相色谱检测了氯氰菊酯的含量。氯氰菊酯经DZS-3作用3 d后，DZS-3对氯氰菊酯的降解率为65.7%。图2为经气相色谱检测，DZS-39在9 d内对氯氰菊酯的降解情况。

　　由图2可以看出，前3 d DZS-3对氯氰菊酯的降解速率较快，3 d后降解逐渐变缓慢。可能是氯氰菊酯在降解的过程中产生了对其自身降解有抑制作用的中间产物。

　　2.3 高效降解菌生长曲线

　　该菌体的生长曲线（图3）与常规的生长曲线不同，一般生长曲线包括滞后期、指数期、稳定期和衰退期，而该菌的生长曲线没有稳定期。可能是氯氰菊酯在降解的过程中产生了某些严重抑制DZS-3生长的代谢产物，使菌体细胞迅速死亡裂解。

　　2.4 氯氰菊酯降解菌的鉴定

　　2.4.1 氯氰菊酯降解菌DZS-3的形态特征通过简单染色、革兰氏染色等生物学技术初步鉴定DZS-3降解菌的形态特征。菌落为针尖状，表面光滑，无颜色，有轻微的气味，显微镜下形状呈短杆状。经革兰氏染色鉴定，DZS-3为革兰氏阴性菌。

　　2.4.2 16S rDNA同源性比较为了确定降解菌的种类，采用比较常用的分类学指标——16S rDNA序列同源性比较。

　　通过菌落PCR扩增16S rDNA，扩增产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小如图4所示。将扩增得到的16S rDNA片段的测序结果与NCBI数据库中的16S rDNA序列进行对比，菌株DZS-3与嗜麦芽寡养单胞菌PSM-2的16S rDNA一致性达到99%，将其初步鉴定为寡养单胞菌属的一种。

　　应用序列比对软件ClustalX 1.8软件对菌株的16S rDNA序列与相似性较高的16S rDNA序列进行比对，用系统发育分析软件Mega 5.03构建系统发育树，DZS-3系统发育进化树见图5。

　　2.4.3 DZS-3生理生化特性 DZS-3生理生化实验结果见表1。表1结果与嗜麦芽寡养单胞菌的模式菌株ATCC13637的特性除少数不同外基本上一致，模式菌株不能产酸，可以液化明胶，DZS-3可以产酸但不能液化明胶。

　　2.5 菌株对抗生素的敏感性

　　为明确DZS-3对各种抗生素的敏感性，对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等4种抗生素做了抗性试验。每种抗生素做了3个不同浓度梯度， DZS-3在加有不同浓度抗生素氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素的LB培养基中均表现出良好的生长状态，但是在氯霉素中不能生长。表明DZS-3在试验浓度内对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素都有抗性，对氯霉素敏感。由于DZS-3对多种抗生素具有抗性，这将影响其以后在环境中释放和应用。

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